陶瓷膜法提取多拉菌素的研究
行業(yè)動(dòng)態(tài)
多拉菌素為20世紀(jì)90年代研制開發(fā)的新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥，其生物合成途徑是以環(huán)己烷羧酸為前體，經(jīng)多步生物合成，形成多拉菌素。其產(chǎn)生菌為基因工程菌，是產(chǎn)阿維菌素的阿維鏈霉菌經(jīng)基因重組后，而得到主產(chǎn)多拉菌素的基因工程菌。多拉菌素是一種阿維菌素類抗生素，是阿維菌素的第三代衍生物。與其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不同，其生物學(xué)活性主要表現(xiàn)為高效驅(qū)殺動(dòng)物體內(nèi)外寄生蟲。經(jīng)過近20年的研究，它被認(rèn)為是目前阿維菌素族中優(yōu)秀的抗寄生蟲藥物之一，因其具有驅(qū)蟲范圍廣、半衰期長、作用效果好、體內(nèi)殘留低和無不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，是目前具有開發(fā)潛力的獸用抗寄生蟲藥物之一。
多拉菌素屬脂溶性藥物，可溶于許多有機(jī)溶劑如二甲基甲酰胺、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙二醇和二甲基亞砜等，但在水中的溶解度極低，僅為0.0006～0.0009mg/L，相對分子質(zhì)量為899.11。由于多拉菌素屬于胞內(nèi)產(chǎn)物，存在于菌體內(nèi)，且發(fā)酵液中組分十分復(fù)雜，多拉菌素的濃度很低，需通過各種分離提取技術(shù)來實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的富集。目前，國內(nèi)一方面由于有專利的限制，生產(chǎn)多拉菌素的廠家較少，對于多拉菌素的需求主要依賴于進(jìn)口；另一方面，對多拉菌素的工業(yè)化生產(chǎn)起步較晚，分離純化工藝等還缺乏系統(tǒng)性的研究。本文主要研究了陶瓷膜法提取多拉菌素工藝，優(yōu)化了工藝過程中的操作參數(shù)，旨在闡述陶瓷膜提取技術(shù)比傳統(tǒng)提取技術(shù)的優(yōu)勢，從而實(shí)現(xiàn)陶瓷膜技術(shù)在多拉菌素提取中的工業(yè)化應(yīng)用。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 材料性質(zhì)和前處理
多拉菌素發(fā)酵液由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供，呈灰色的渾濁狀，濕固含量40%～42%，黏度700mPa·s，pH7～8，發(fā)酵液溫度37℃。
1.1.2 化學(xué)試劑
HPLC用的甲醇和乙腈均為色譜純，購自Fisher公司；提取用的甲醇為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。
1.2 陶瓷膜設(shè)備
陶瓷膜元件：陶瓷膜材質(zhì)為氧化鋁、氧化鋯或氧化鈦，通道數(shù)為19，長度1200mm，平均孔徑為50nm。膜組件：單支膜組件，面積0.42㎡。陶瓷膜設(shè)備為防爆型。其中泵參數(shù)：流量Q=5.8m3/h，揚(yáng)程H=56.5m，功率P=1.1kW。
1.3 方法
1.3.1 試驗(yàn)方法
（1）傳統(tǒng)提取法：將50mL多拉菌素發(fā)酵液先經(jīng)3500r/min離心10min，棄濾液，收集固體物（菌體）。菌體用甲醇浸泡，于室溫下，震蕩提取12h，再經(jīng)離心，去除大分子等沉淀物，收集離心液，即得到多拉菌素甲醇提取液。并應(yīng)用高效液相色譜分別檢測發(fā)酵液和甲醇提取液中的多拉菌素含量。
往菌體中分別添加1、1.5、2、2.5、3、3.5和4BV（BV表示倍數(shù)，質(zhì)量比，相對于發(fā)酵液，以下皆同）甲醇溶液提取1次，考察不同甲醇添加倍數(shù)對多拉菌素收率的影響；在較優(yōu)甲醇添加倍數(shù)的前提下，對收集的菌體分別提取1次、2次和3次，考察不同甲醇提取次數(shù)對多拉菌素收率的影響。
（2）陶瓷膜提取法：將40kg多拉菌素發(fā)酵液置于陶瓷膜設(shè)備中，采用錯(cuò)流過濾方式，設(shè)定操作壓力2.3bar，膜面流速4m/s，溫度30～45℃，將發(fā)酵液濃縮至2.67倍，棄去陶瓷膜滲透液，獲得循環(huán)罐中的菌體；然后開始加1.5BV純水連續(xù)洗濾菌體；待結(jié)束后再用3BV甲醇溶液連續(xù)提取菌體中的多拉菌素，收集陶瓷膜滲透液，即為多拉菌素甲醇提取液。并應(yīng)用高效液和色譜分別檢測發(fā)酵液和甲醇提取液中的多拉菌素含量。
（3）陶瓷膜操作參數(shù)的優(yōu)化：
①膜面流速的優(yōu)化：取40kg多拉菌素發(fā)酵液置于陶瓷膜設(shè)備中，提高膜面流速至5m/s，控制操作壓力2.3bar，溫度23～44℃，陶瓷膜濃縮2.67倍，加1.5BV純水連續(xù)洗濾菌體，加3BV甲醇連續(xù)提取多拉菌素，考察膜面流速對陶瓷膜過濾通量的影響。
②操作壓力的優(yōu)化：取40kg多拉菌素發(fā)酵液置于陶瓷膜設(shè)備中，設(shè)定濃縮階段操作壓力1.3bar，加1.5BV純水連續(xù)洗濾階段操作壓力1.8bar，加3BV甲醇連續(xù)提取階段操作壓力2.4bar，膜面流速5m/s，溫度27～45℃，陶瓷膜濃縮2.67倍，按照以上方法提取多拉菌素，考察階段性提高操作壓力對陶瓷膜過濾通量的影響。
1.3.2 分析方法
（1）有效成分的測定：采用高效液相色譜法。
（2）膜表征方法：陶瓷膜水通量測定：設(shè)備穩(wěn)定運(yùn)行10min后，直至水通量基本穩(wěn)定，測定條件為1bar、常溫下測量水通量。可直接讀取浮子流量計(jì)刻度或通過以下公式計(jì)算：
J=Z/(S×t)
式中：J為水通量，單位L/(h·㎡)；Z為t時(shí)間內(nèi)滲透水的體積，單位L；S為膜面積，單位㎡；t為測量的時(shí)間，單位h。
料液通量測定：測定膜過濾過程中某一時(shí)間段的通量情況，即計(jì)算出單位時(shí)間、單位膜面積滲透液的通量值。
膜過濾通量測定：記錄膜過濾的耗時(shí)（即從進(jìn)料開始至停止出料所用時(shí)間），測定系統(tǒng)滲透液的總質(zhì)量，并計(jì)算出單位時(shí)間、單位膜面積濾液的通量值。
多拉菌素的收率：物料提取后多拉菌素質(zhì)量與發(fā)酵液中多拉菌素質(zhì)量的百分比。
2 結(jié)果與討論
2.1 傳統(tǒng)工藝提取多拉菌素
鄒澤先等考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮及異丙醇等提取試劑對多拉菌素提取的效果差異，結(jié)果表明以乙腈及甲醇的提取效果較好，且兩者差異不顯著，但甲醇的成本及毒性均較乙腈低，故提取試劑選擇甲醇。往菌體中分別添加1、1.5、2、2.5、3、3.5和4BV甲醇溶液提取1次，隨著甲醇添加倍數(shù)的提高，多拉菌素的提取收率越高。當(dāng)添加倍數(shù)為3BV時(shí)，收率提高幅度有所下降，且溶劑添加的越多，也增加了甲醇購買和后續(xù)回收的成本，因此選擇甲醇添加倍數(shù)為3BV，其收率可達(dá)92.1%。
按照甲醇添加倍數(shù)為3BV，提取1次、2次和3次多拉菌素收率分別為92.3%、96.3%和97.3%。結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，收率呈現(xiàn)逐漸提高的趨勢，提取3次時(shí)收率僅提高了0.8%，故選擇對發(fā)酵液進(jìn)行甲醇提取2次。
2.2 陶瓷膜法提取多拉菌素
多拉菌素為胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，不溶于水，可溶于大部分有機(jī)溶劑。傳統(tǒng)工藝一般通過離心收集和洗滌菌體，再將菌體通過有機(jī)溶劑溶出或機(jī)械破碎的方式提取其中有效成分，目前普遍采用較為安全有機(jī)溶劑甲醇來提取。此法主要存在人工操作復(fù)雜、處理時(shí)間長、收率低等缺點(diǎn)，因此，下文主要研究了陶瓷膜法提取多拉菌素發(fā)酵液，考察陶瓷膜技術(shù)對多拉菌素提取的影響，并優(yōu)化操作參數(shù)，如操作壓力和膜面流速等。
2.2.1 陶瓷膜提取技術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由于物料固含量較高，隨著濃縮倍數(shù)的提高，通量急劇下降，陶瓷膜濃縮2.67倍，瞬時(shí)通量僅為25L/(㎡·h)。起始加甲醇使得整體濃度下降，通量明顯升高，但隨著提取時(shí)間的延長，胞內(nèi)的部分大分子物質(zhì)也被溶出，且逐漸污染陶瓷膜，使得膜通量也呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。設(shè)備運(yùn)行130和270min時(shí)的通量存在振蕩，主要是由于加水洗濾和加甲醇提取每次1L，視為連續(xù)，在這期間通量也存在起始較高，然后隨著濃度升高，通量逐漸下降的趨勢，主要是存在檢測時(shí)間偏差的問題。本次試驗(yàn)共出陶瓷膜滲透液205kg，耗時(shí)360min，膜過濾通量可達(dá)81.3kg/(㎡·h)。陶瓷膜滲透液澄清透明，無菌體或細(xì)胞碎片透出，收率可達(dá)97.6%，其結(jié)果均優(yōu)于傳統(tǒng)除雜提取工藝。因此，陶瓷膜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多拉菌素的連續(xù)提取。
2.2.2 陶瓷膜膜面流速的優(yōu)化
膜面流速的提高有利于增大料液與膜之間的剪切力，從而減緩膜污染的速度。本次試驗(yàn)提高膜面流速至5m/s。提高膜面錯(cuò)流流速可提高料液通量，主要表現(xiàn)在整體瞬時(shí)通量提高，且通量下降幅度減小。共出陶瓷膜滲透液205kg，耗時(shí)290min，膜過濾通量可達(dá)100.9kg/(㎡·h)，比膜面流速4m/s提高了24.1%，收率可達(dá)97.2%。因此，可將膜面流速提至5m/s。
2.2.3 陶瓷膜操作壓力的優(yōu)化
由于多拉菌素發(fā)酵液固含量較高，對膜的污染較為嚴(yán)重，通量也隨之大幅度下降，且操作壓力與膜污染的程度呈正相關(guān)，故本次實(shí)驗(yàn)采用階段性提高操作壓力的方式來緩解膜污染的速度。從發(fā)酵液中陶瓷膜法提取多拉菌素分為濃縮階段、洗濾階段和提取階段，相對前2批實(shí)驗(yàn)，3個(gè)階段的通量降幅越來越小，越來越穩(wěn)定，表明膜污染得以減緩。共出陶瓷膜滲透液205kg，耗時(shí)245min，膜過濾通量可達(dá)119.5kg/(㎡·h)，比在膜面流速4m/s和操作壓力2.3bar時(shí)的通量提高了47.0%，收率可達(dá)97.5%。因此，采用階段性提高操作壓力有利于提高陶瓷膜過濾通量。
2.3 傳統(tǒng)工藝和陶瓷膜工藝的比較
根據(jù)“2.1”和“2.2”項(xiàng)的試驗(yàn)結(jié)果，分別設(shè)計(jì)出多拉菌素發(fā)酵液處理能力為2t/h的傳統(tǒng)工藝和陶瓷膜工藝，并從設(shè)備運(yùn)行成本、工藝設(shè)計(jì)和人工等進(jìn)行比較。
以發(fā)酵液處理能力為2t/h（16t/d，300d/年）的傳統(tǒng)工藝和陶瓷膜工藝進(jìn)行比較。傳統(tǒng)工藝需要配置5t/h處理量的國產(chǎn)離心機(jī)收集和洗滌菌體，處理時(shí)間8h；120m3的罐子進(jìn)行甲醇攪拌提取，處理時(shí)間12h；還需20t/h處理量的進(jìn)口離心機(jī)，用于提純多拉菌素，處理時(shí)間5h，再加上準(zhǔn)備時(shí)間，總共耗時(shí)24h。而陶瓷膜工藝則需要配置4個(gè)91芯的組件，膜面積共152㎡即可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)需求，處理時(shí)間10h（包括清洗時(shí)間2h）。傳統(tǒng)工藝3個(gè)工段3班倒共需要12個(gè)人，而陶瓷膜工藝僅1班即可實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)。且相對于傳統(tǒng)工藝，陶瓷膜工藝可減少一半甲醇提取用量，即每年可減少14400t的甲醇用量，收率還高出1.2%。傳統(tǒng)工藝的設(shè)備折舊費(fèi)（折舊按10年計(jì)算，包括每年的耗材費(fèi)）和人工成本使得整個(gè)運(yùn)行成本超過陶瓷膜工藝（陶瓷膜折舊5年，膜設(shè)備折舊10年），每噸物料處理費(fèi)用增加4.1元以上（不包括溶劑成本和收率折算后的利潤）。
2.4 陶瓷膜清洗方法
多拉菌素發(fā)酵液中含有較多的菌體、蛋白質(zhì)以及培養(yǎng)基殘留成分等，陶瓷膜過濾會(huì)產(chǎn)生膜表面污染，甚至是膜孔內(nèi)污染，影響陶瓷膜的下一次過濾性能。因此，必須對膜進(jìn)行周期性的清洗。常規(guī)陶瓷膜的清洗可先用水沖刷，去除膜表明的可逆污染，由于陶瓷膜耐酸、耐堿、耐氧化劑的特性，再結(jié)合化學(xué)試劑和循環(huán)清洗對污染物進(jìn)行分解、置換作用，通過錯(cuò)流所形成的剪切力去除不可逆污染。
通過多次實(shí)驗(yàn)考察，清洗方法如下：配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%（以循環(huán)水質(zhì)量計(jì)，下同）的NaOH和0.5%～1%的NaClO溶液進(jìn)行循環(huán)清洗1h，再用清水沖洗至中性，陶瓷膜的水通量即可達(dá)到初始的99%，甚至更佳。
3 結(jié)論
3.1 傳統(tǒng)工藝和陶瓷膜工藝的優(yōu)化
優(yōu)化后的多拉菌素傳統(tǒng)工藝的收率達(dá)96.3%，甲醇提取次數(shù)2次，每次添加用量為3BV（質(zhì)量比，相對于發(fā)酵液，以下皆同）。優(yōu)化后的陶瓷膜工藝的收率達(dá)97.5%，膜面流速5m/s，溫度小于45℃，采用階段性提高操作壓力的方法，連續(xù)純水洗濾1.5BV，連續(xù)甲醇提取3BV，膜過濾通量可達(dá)119.5kg/(㎡·h)，比優(yōu)化前提高了47.0%。
3.2 傳統(tǒng)工藝和陶瓷膜工藝的對比
比較了處理能力2t/h的傳統(tǒng)工藝與陶瓷膜工藝，陶瓷膜法操作時(shí)間縮減2倍，人工減少5倍，甲醇用量減少1倍，且收率仍然高出1.2%，每噸物料處理費(fèi)用減少4.1元以上。
3.3 陶瓷膜的再生
采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～2%的NaOH與0.5%～1%的NaClO混合清洗的方法，清洗后陶瓷膜的水通量重復(fù)恢復(fù)率可達(dá)99%以上，再生性較好。
