牡蠣酶解液分離方法的研究
技術(shù)支持
牡蠣，又名蠔，是沿海常見的一種珍貴貝類，它滋味鮮美，營養(yǎng)豐富，不僅含有大量的蛋白質(zhì)、維生素、牛磺酸等營養(yǎng)成分，還有豐富的糖原，具有很好的抗氧化抗衰老功效，有“海底牛奶”的美稱。隨著人們對牡蠣的成分、保健功能的進一步了解，近年來對牡蠣的研究也越來越多，主要集中在對生鮮牡蠣肉的酶解方面，用于制備風味基料和具有保健功能的牡蠣口服液，而對于牡蠣酶解液的分離方式和方法報道較少，由于牡蠣酶解液含有較多的雜質(zhì)，如：貝殼、沙子以及未分解的蛋白和其他成分，如果不進行分離，會嚴重影響酶解液的應(yīng)用效果。本研究結(jié)合中試的實驗設(shè)備，探討了牡蠣酶解液的分離方法，為牡蠣的工業(yè)化應(yīng)用提供了參考。
1 材料與方法
1.1 材料與設(shè)備
牡蠣 購于市場；一水檸檬酸、食鹽 市售；堿性蛋白酶（酶活2.4U/g）、風味蛋白酶（500LAPU/g） 諾維信生物技術(shù)有限公司。
碟式分離機 Alfalaval；pHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠；多管架臺式離心機 湖南湘儀離心設(shè)備廠；電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；酶解罐 上海天宇機械有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 分析方法
水分含量測定：直接干燥法（參照GB/T5009.3-2011）；
灰分含量測定：灼燒法（參照GB/T5009.4-2010）；
粗蛋白含量測定：凱氏定氮法（參照GB/T5009.5-2010）；
氨基態(tài)氮：甲醛滴定法（參照GB/T5009.39-2003）；
揮發(fā)性鹽基態(tài)氮：半微量凱氏定氮法（參照GB/T5009.44-2003）；
粗脂肪含量測定：索氏抽提法（參照GB/T5009.6-2003）。
1.2.2 酶解液的制備
將牡蠣添加1:1的水，用膠體磨磨細，調(diào)節(jié)pH至6.5～7.0，加入總量0.05%的堿性蛋白酶和0.05%的風味蛋白酶，攪拌均勻，在55～60℃酶解12h，檢測指標合格后，加熱至85℃滅酶20min，儲存?zhèn)溆谩?/span>
1.2.3 沉降速度的測定
取被測樣品，加入100mL量筒內(nèi)，定量至100mL，靜置，使懸浮液中的固體顆粒自然沉降，待靜置2h后，以上層清液和下層渣的分界線為基準，檢測上層清液的高度和渣的高度，沉降速度（cm/h）=清液可視容積/總?cè)莘e/2=清液可視高度/溶液總高度/2。
1.2.4 碟式分離機離心
按照確定的加熱絮凝方式對酶解液進行前處理，采用碟式分離機對酶解液進行離心，過程中調(diào)整分離機的流量、背壓和排渣時間。
1.2.5 離心效果的驗證
取20g酶解液加熱到85℃，然后靜置保溫15min，把酶解液輕輕傾入離心管中，定量離心管中的酶解液為10g，將處理好的樣品放到多管架臺式離心機上離心，離心機轉(zhuǎn)速設(shè)定為4000r/min，離心時間5min，離心完畢后小心傾出上層清液，測定下層渣的重量，渣含量（%）=渣的重量/酶解液總重量。
2 結(jié)果與討論
將牡蠣酶解液在85℃加熱15min，輕輕傾入離心管中，放入多管架臺式離心機上離心，離心機轉(zhuǎn)速設(shè)定為4000r/min，離心時間5min，離心后輕輕倒出上層清液，取下層沉淀進行指標分析，如下表：
粗蛋白 | 脂肪 | 鹽分 | 灰分 | 其他 |
64.4 | 7.7 | 3.33 | 8.8 | 15.77 |
通過指標的分析可以發(fā)現(xiàn)，沉淀主要為粗蛋白、脂肪以及灰分，酶解過程中一些未分解完全的蛋白，在加熱過程中變性絮凝成大分子物質(zhì)，在密度差的影響下，逐步沉淀到下層，脂肪本身的密度雖然相對低，但其與蛋白質(zhì)結(jié)合起來形成大分子，也沉淀到酶解液的下層。由沉淀的現(xiàn)象可以分析出，酶解液中的大分子物質(zhì)與清液之間存在一定的密度差，從原來來看，是可以通過離心的方式來去除沉淀的。
工業(yè)化生產(chǎn)酶解液，要求分離效果好，效率高，至少達到10m3/h以上，且能夠連續(xù)操作。結(jié)合雜質(zhì)的沉降特性以及設(shè)備特性，本實驗選擇碟式分離機進行分離，碟式分離機的分離因數(shù)較高，可達3000～10000，碟片數(shù)較多，增大了沉降面積，碟片間的相互空隙小，縮短了沉降距離，因此分離效果較好，且結(jié)構(gòu)簡單、分離成本低。本實驗用碟式分離機對加熱后的酶解液直接進行分離，分離效果較差，沉淀難以離心出，主要因為沉淀與清液間的密度差太小，因此需要對酶解液進行絮凝前處理，加大兩相之間的密度差。
2.1 酶解液的絮凝效果研究
酶解液的絮凝效果受加熱溫度、加熱時間、降溫時間、降溫速度、pH以及絮凝劑種類的影響，本實驗探討了各種影響因素對牡蠣酶解液絮凝效果的影響。
2.1.1 加熱溫度和加熱時間對雜質(zhì)的絮凝效果
牡蠣酶解液在各種溫度下的絮凝效果都較差，加熱到80～85℃也僅有少量的絮凝，將以上樣品放置常溫24h，未出現(xiàn)分層，說明單純通過加熱的方式來對酶解液進行絮凝，未能完全破壞膠體周圍的水合系統(tǒng)，膠體粒子之間的靜電引力不夠，發(fā)生凝聚的速度很慢，難以達到分離的效果。
2.1.2 pH對酶解液絮凝效果的影響
當溶液的pH處在蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)分子的靜電荷為零，分子相互間的疏水作用較強，蛋白質(zhì)分子相互吸引形成更大的分子聚集體，形成沉淀，本研究通過一水檸檬酸來調(diào)整酶解液的pH，在85℃加熱，常溫下沉淀，比較不同pH條件下的蛋白質(zhì)絮凝效果。
時間（min） | pH | ||
4.5 | 5.0 | 6.0 | |
5 | 迅速絮凝 | 迅速絮凝 | 無絮凝 |
15 | +++ | +++ | 無絮凝 |
30 | ++ | ++ | 無絮凝 |
沉降速度（cm/h） | 4 | 4 | ＜0.1 |
澄清度 | 好 | 好 | 差 |
注：表中沉降速度是以樣品加熱保溫30min后進行測定，“+”越多表示絮凝的沉淀越多。
從絮凝的現(xiàn)象來看，pH在4.5～5.0之間，酶解液中蛋白質(zhì)的絮凝效果較好，當達到6.0時就無絮凝產(chǎn)生，因此可確定牡蠣酶解液中蛋白的等電點約在4.5～5.0之間，通過調(diào)整pH至蛋白的等電點可以起到較好的絮凝效果，且絮凝時間短，在15～20min即可以達到較好的效果。絮凝之后不適宜長時間加熱，繼續(xù)加熱會導致分子運動加劇，使結(jié)合的聚集體重新分散開，不利于后續(xù)的分離。
2.1.3 絮凝劑對酶解液絮凝效果的影響
絮凝劑是借助無機或有機的離子或分子，在膠體粒子間起到架橋作用，從而使固體粒子團聚成較大顆粒，本實驗采用幾種絮凝劑對酶解液進行處理。
從幾種絮凝劑的絮凝和沉降效果來看，氯化鈣的效果較好，但跟直接調(diào)節(jié)pH至等電點的效果相差不大，因此確定采用調(diào)節(jié)酶解液的pH至4.5～5.0，加熱至85℃保溫15min，自然降溫進行絮凝。
2.2 離心分離的優(yōu)化
2.2.1 分離機參數(shù)的確定
在酶解液充分絮凝的前提下，采用兩相離心的方式對酶解液進行離心，固定碟式分離機的轉(zhuǎn)速為9360r/min（碟式分離機具有操作面板，有電子顯示其轉(zhuǎn)速），排渣時間為20min，調(diào)節(jié)背壓保證流量穩(wěn)定，比較不同流量下清液的澄清效果。
從離心效果來看，離心的流量低，則離心后清液中渣的含量會相應(yīng)減少，當離心流量從150～200L/h時，渣的含量變化不大，綜合設(shè)備的穩(wěn)定運行要求，確定采用200L/h；離心前渣含量為4.85%，離心后渣含量為0.68%，離心去除了約86%的渣，基本可以達到酶解液應(yīng)用的品質(zhì)要求。
2.2.2 溫度對離心效果的影響
實驗固定離心的流量為200L/h，分離機的轉(zhuǎn)速為9360r/min，排渣時間為20min，比較不同溫度下清液的澄清效果。
結(jié)果表明，當酶解液的溫度為60℃時，離心后清液渣的含量較低，溫度高離心的效果反而不好，原因可能是離心的溫度高，分子運動劇烈，兩相之間的密度差減小，因此可將酶解液進行絮凝冷卻到60℃保溫進行離心處理。
2.2.3 離心前后酶解液指標的變化
離心后的氨基態(tài)氮較離心前降低0.01%，全氮降低0.15%，揮發(fā)性鹽基氮降低25%左右，說明渣中所含的揮發(fā)性鹽基氮含量較高，離心去渣可有效改善牡蠣酶解液的風味。
全氮指標計算：
渣降低4.85%-0.68%=4.17%
渣中的干物質(zhì)含量為34.8%，則渣中的全氮為：4.17%×34.8%×64.4%/6.25=0.15%
因而損耗的全氮為0.15%
2.3 均勻設(shè)計法確定各分離參數(shù)的影響
實驗采用U6（64）等水平均勻設(shè)計表對加熱溫度、加熱時間、加熱pH，以及離心的轉(zhuǎn)速進行詳細的考察，實驗結(jié)果采用回歸分析法，確定各參數(shù)的影響。
對以上的實驗結(jié)果進行回歸分析，對回歸方程進行方差分析。由方差分析可知，所求得的回歸方程非常顯著。
通過計算，四個標準化偏回歸系數(shù)分別為b1’=1.005×10-4，b2’=0.6630，b3’=6.1447，b4’=6.7632，可見因素主次順序為：離心流量＞加熱pH＞絮凝時間＞溫度。
3 結(jié)論
本研究對牡蠣酶解液的沉淀成分進行了分析，確定主要成分為蛋白和脂肪，確定采用調(diào)等電點加熱絮凝的方式對酶解液進行前處理，通過調(diào)節(jié)pH至4.5～5.0，加熱至85℃保持15min，后降溫至60℃，采用碟式分離機進行離心，當分離機轉(zhuǎn)速為9360r/min，流量為200L/h，排渣時間為15min時，可去除86%以上的雜質(zhì)，離心前后氨基態(tài)氮變化不大，且可以減少25%左右的揮發(fā)性鹽基氮，離心去渣可有效提高牡蠣酶解液的風味，達到了后工序?qū)γ附庖旱钠焚|(zhì)要求。通過等水平均勻設(shè)計實驗確定了各因素對離心效果的影響大小為：離心流量＞加熱pH＞絮凝時間＞絮凝溫度。
